全面的真菌荧光染色剂选择与使用指南。荧光染色是临床真菌学诊断中一项非常重要的技术，能显著提高真菌检出率和判读速度。

核心前言与安全须知

真菌荧光染色剂核心价值：荧光染色通过染料与真菌细胞壁（几丁质、β-葡聚糖）特异性结合，在荧光显微镜下发出明亮荧光，使真菌形态（菌丝、孢子）在复杂的背景（如组织碎片、黏液）中凸显出来，灵敏度高于常规KOH湿片法。

安全第一：

个人防护：操作时必须佩戴手套、实验服，部分染料可能要求佩戴口罩和护目镜。

废弃物处理：染色后的玻片、试剂等需按生物危害废弃物规范处理。

荧光显微镜：使用后及时关闭汞灯光源以延长寿命，避免眼睛直视激发光。

第一部分：常用真菌荧光染色剂选择指南

以下列举临床最常用的几种染色剂，并对比其特点。

真菌荧光染色剂名称

主要靶点/原理

真菌荧光颜色

背景颜色

主要优点

主要缺点/注意

典型应用场景

钙荧光白

与真菌细胞壁的β-葡聚糖和几丁质结合。

亮蓝色

暗黑色

金标准。灵敏度、对比度极高。适用性广。染色快（1-2分钟）。

需荧光显微镜（DAPI滤光片组即可）。需含KOH的染色液以透明角质。

最推荐通用。皮肤癣菌、念珠菌、丝状真菌、卡氏肺孢子菌等。

**Uvitex 2B

同上。

亮蓝色

暗黑色

与钙荧光白效果类似，有时对比度更佳。

同上。在某些地区可能不易获得。

同上，是钙荧光白的良好替代。

CFW染色液

即Calcofluor White M2R，与钙荧光白同属一类。

亮蓝色

暗黑色

商业试剂盒常用，性能稳定。

同上。

临床实验室最常用的商品化试剂。

荧光增白剂28

同上。

亮蓝色

暗黑色

化学名称，本质是同一类物质。

同上。

常用于科研和部分试剂。

Blankophor

与纤维素、几丁质结合。

亮蓝色

暗黑色

在欧洲应用较多，性能优秀。

同上。

同钙荧光白。

真菌橙

真菌荧光染色剂与真菌细胞壁的几丁质结合。

橙红色

绿色或暗色

颜色醒目，与蓝色背景区分度好。不易淬灭。

染色时间稍长（5-10分钟）。需专用荧光滤光块（如TRITC）。

非常适合与CFW联用进行双重染色确认。

**Acridine Orange

可插入核酸（DNA/RNA）。

橙红色/绿色 (取决于染料聚集状态)

反差明显

能同时显示有代谢活性的真菌和细菌。

染色和镜检需快速完成，易淬灭。判读需经验。

快速筛查混合感染（如真菌+细菌）。

真菌荧光染色剂选择建议：

对于绝大多数常规临床实验室，首选含KOH的钙荧光白商业试剂盒。它平衡了性能、速度和成本。

若有条件，可备真菌橙，用于疑难样本或双重染色，提高特异性。

科研或特殊需求可考虑吖啶橙等其他染料。

第二部分：标准化使用步骤（以钙荧光白试剂盒为例）

【样本制备】

临床样本（皮屑、甲屑、痰液、BALF、组织刮取物等）置于清洁载玻片上。

滴加1-2滴含KOH的钙荧光白染色液。确保样本被覆盖。

盖上盖玻片，静置1-2分钟，让KOH消化背景组织并使染料结合。对于角质过厚的样本（如甲屑），可稍延长静置时间或微加热，但避免过度加热使KOH结晶。

（可选）轻压盖玻片使样本变薄、铺开。

【镜检观察】

使用荧光显微镜，选用DAPI滤光块（激发光~360nm，发射光~460nm）。

先在低倍镜（10×） 下扫描，寻找可疑荧光区域。

切换到高倍镜（40×）或油镜（100×） 观察真菌形态细节。

典型形态：

菌丝：呈亮蓝色、分枝或分隔的管状结构。

孢子：呈亮蓝色的圆形或卵圆形小体。

假菌丝/芽生孢子（念珠菌属）：可见出芽和连接。

真菌荧光染色剂【结果判读与报告】

阳性：观察到特征性的真菌荧光形态。报告应描述形态（如：分隔菌丝、关节孢子、芽生孢子等）。

阴性：未观察到典型真菌结构。但阴性不能完全排除感染，可能与样本量、病原体负荷或染色技术有关。

注意事项：某些纤维素纤维（如棉、纸）也可能发出微弱荧光，需根据形态仔细鉴别。

第三部分：疑难解答与进阶技巧

背景荧光太强：

原因：染色时间过长、KOH未充分消化、样本过厚、染料非特异性吸附。

解决：优化样本消化时间；确保染色后吸去多余染液；样本制备更薄。

荧光信号弱或无：

原因：染料失效、镜检滤光片不匹配、光源老化、样本中真菌量极少。

解决：检查试剂有效期和储存条件；确认使用正确的滤光块；定期维护显微镜；仔细扫描全片。

形态不典型难以确认：

解决：结合真菌橙双重染色。先用CFW染色镜检，同一区域再用真菌橙染色，若均显示相同形态且为橙红色荧光，则确认是真菌。

对于疑似卡氏肺孢子菌，CFW下呈圆形或杯状囊壁，内部有特征性的点状或括号状结构。必要时需用吉姆萨或六胺银染色确认。

提高阳性率：

确保采集到足量、合格的临床样本。

对于痰液等黏稠样本，可先用二硫苏糖醇处理液化，再离心取沉淀涂片染色。

由经验丰富的检验人员系统性地扫描全片。

总结

真菌荧光染色是一项强大而快速的初筛技术。成功的关键在于：

选择正确的染色剂（钙荧光白是通用首选）。

规范的样本制备和染色流程。

使用状态良好的荧光显微镜及正确的滤光块。

检验人员对真菌形态学的扎实知识和仔细的镜检态度。

真菌荧光染色剂将荧光染色作为常规KOH法的升级替代或补充，能极大提升临床真菌学检测的效率和准确性，为抗真菌治疗的精准决策提供关键的第一手证据。