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双重染色法免疫荧光组织化学染色步骤

发布时间:2021-06-10 11:55:02 人气:

免疫荧光细胞化学双重染鱼法

原代培养胚胎14天大鼠端脑细胞:在骨发生形态蛋白―{诱导下,乙酰胆碱转移酶(呈绿色荧光)和同源域蛋白Islet―1(呈红色荧光)共存于细胞质内(激光扫描共聚焦显微镜观察)

 

1.一步双染色法先将两种荧光标{己抗体按适当比例混合(A+B),按直接法进行染色。

 

2.二步双染色法先用TRITC标记的A抗体进行免疫荧光染色,再用FITC标记的B抗体染色,根据两种抗体的动物种属不同,可用直接法也可用间接法,结果A抗原呈现橘红色荧光,而B抗原呈现黄绿色荧光。在应用中,常用的方法是免疫荧光组织化学中间接法和SABC-Cy3法相结合。例如,在实验设计时,选择小鼠抗大鼠A和兔抗大鼠B作为两种不同的特异性一抗,相匹配的二抗分别为FITC-抗小鼠IgG和生物素化―抗兔IgG。

进行双重染色时,由于两种一抗种属来源不同,可把一抗混合使用。孵育结束后洗涤未结合的一抗,滴加二抗时,先加人生物素化―抗兔IgG(二抗)孵育,洗涤后,滴加SABC-Cy3复合物,经荧光显微镜下观察已出现特异性荧光,再进行FITC―抗小鼠IgG(二抗)的孵育,最后封片观察。其结果A抗原呈现绿色荧光,B抗原呈现红色荧光。

此法应注意两种一抗在混合稀释时,抗体的终浓度应为每一种抗体的工作浓度。换言之,混合后的液体要同时满足两种一抗的工作浓度。若两种一抗种属来源相同,必须分两次进行双重染色,即先用第一种一抗和第一种荧光二抗对A抗原进行染色,洗涤后,用第二种一抗和第二种荧光二抗对B抗原进行染色,否则会出现交叉反应而使染色无特异性。

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