真菌荧光染色液在荧光显微镜下观察的标准染色方案，核心是 “样本预处理→染色孵育→荧光镜检” 的标准化流程，关键控制点在于染色时间、试剂用量和镜检参数，以下是可直接落地的操作规范。

一、真菌荧光染色液适用范围

适用于痰液、皮屑、甲屑、脑脊液、阴道分泌物等临床样本，可观察念珠菌、曲霉菌、隐球菌、皮肤癣菌等常见致病真菌的孢子、菌丝形态。

二、核心试剂与设备

试剂：真菌荧光染色液（含荧光探针、背景抑制剂、封片剂）、生理盐水（样本稀释用）；

设备：荧光显微镜（配备 UV / 蓝光激发滤光片，发射波长 450-490nm）、一次性载玻片 / 盖玻片、滴管、恒温孵育箱（可选）。

三、标准染色操作步骤

样本预处理（1-2 分钟）

液体样本（痰液、脑脊液）：取 10-20μL 样本滴于载玻片中央，用滴管轻轻涂抹成均匀薄层（厚度≤0.1mm），避免重叠；

固体样本（皮屑、甲屑）：用生理盐水将样本研磨成混悬液，取上清液涂片，自然干燥（或 37℃恒温箱干燥 30 秒）。

染色孵育（3-5 分钟）

用滴管滴加 2-3 滴真菌荧光染色液，完全覆盖样本涂片区域，室温孵育 2 分钟（无需避光）；

吸去多余染色液，用生理盐水轻轻冲洗载玻片边缘，去除未结合的染料，自然干燥 1 分钟。

封片与镜检（2 分钟）

滴加 1 滴封片剂，覆盖样本区域，盖上盖玻片（避免产生气泡）；

将载玻片置于荧光显微镜载物台，选择蓝光激发通道（激发波长 450-490nm），先低倍镜（10×）扫描全片，再高倍镜（40×）观察目标形态。

四、真菌荧光染色液镜检判断标准

阳性判定：在暗背景下，观察到发出明亮蓝绿色 / 黄绿色荧光的结构，且符合真菌特征：

孢子：圆形 / 椭圆形，大小均匀（2-10μm），荧光强度一致；

菌丝：细长丝状，有分支，荧光连续（区别于杂质的碎片化荧光）；

隐球菌：圆形，荚膜呈弱荧光或无荧光，菌体核心荧光明亮。

阴性判定：全片无特异性荧光结构，仅见弱荧光杂质（形态不规则、无真菌特征）。

五、关键注意事项

染色液需室温保存，避免阳光直射，开封后 1 个月内用完；

涂片厚度需均匀，过厚会导致荧光信号重叠，影响观察；

孵育时间不可超过 5 分钟，否则背景荧光增强，干扰判断；

真菌荧光染色液镜检时避免长时间激发光照射，防止荧光淬灭，建议每视野观察不超过 30 秒。